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显微鉴别法 中国药典2020版四部通则2001

中国药典2020版四部通则2001

显微鉴别法


  显微鉴别法系指用显微镜对药材(饮片)切片、粉末、解离组织或表面制片及含饮片粉末的制剂中饮片的组织、细胞或内含物等特征进行鉴别的一种方法。鉴别时选择具有代表性的供试品,根据各品种鉴别项的规定制片。制剂根据不同剂型适当处理后制片。

  一、 药材(饮片)显微制片

  1.横切片或纵切片制片  取供试品欲观察部位,经软化处理后,用徒手或滑走切片法,切成10~20μm的薄片,必要时可包埋后切片。选取平整的薄片置载玻片上,根据观察对象不同,滴加甘油醋酸试液、水合氯醛试液或其他试液1~2滴,盖上盖玻片。必要时滴加水合氯醛试液后,在酒精灯上加热透化,并滴加甘油乙醇试液或稀甘油,盖上盖玻片。

  2.粉末制片  供试品粉末过四或五号筛,挑取少许置载玻片上,滴加甘油醋酸试液、水合氯醛试液或其他适宜的试液,盖上盖玻片。必要时,按上法加热透化。

  3.表面制片  将供试品湿润软化后,剪取欲观察部位约4mm2,一正一反置载玻片上,或撕取表皮,加适宜的试液或加热透化后,盖上盖玻片。

  4.解离组织制片  将供试品切成长约5mm、直径约2mm的段或厚约1mm的片,如供试品中薄壁组织占大部分,木化组织少或分散存在,采用氢氧化钾法,若供试品质地坚硬,木化组织较多或集成较大群束,釆用硝铬酸法或氯酸钾法。

  (1)氢氧化钾法  将供试品置试管中,加5%氢氧化钾溶液适量,加热至用玻璃棒挤压能离散为止,倾去碱液,加水洗涤后,取少量置载玻片上,用解剖针撕开,滴加稀甘油,盖上盖玻片。

  (2)硝铬酸法  将供试品置试管中,加硝铬酸试液适量,放置至用玻璃棒挤压能离散为止,倾去酸液,加水洗涤后,照上法装片。

  (3)氯酸钾法  将供试品置试管中,加硝酸溶液(1→2)及氯酸钾少量,缓缓加热,待产生的气泡渐少时,再及时加入氯酸钾少量,以维持气泡稳定地发生,至用玻璃棒挤压能离散为止,倾去酸液,加水洗涤后,照上法装片。

  5.花粉粒与孢子制片  取花粉、花药(或小的花)、孢子或孢子囊群(干燥的供试品浸于冰醋酸中软化),用玻璃棒研碎,经纱布过滤至离心管中,离心,取沉淀加新配制的醋酐与硫酸(9:1)的混合液1~3ml,置水浴上加热2~3分钟,离心,取沉淀,用水洗涤2次,取沉淀少量置载玻片上,滴加水合氯醛试液,盖上盖玻片,或加50%甘油与1%苯酚各1~2滴,用品红甘油胶[取明胶1g,加水6ml,浸泡至溶化,再加甘油7ml,加热并轻轻搅拌至完全混匀,用纱布过滤至培养皿中,加碱性品红溶液(碱性品红0.1g,加无水乙醇600ml及樟油80ml,溶解)适量,混匀,凝固后即得]封藏。

  6.磨片制片  坚硬的动物、矿物类药,可采用磨片法制片。选取厚度1~2mm的供试材料,置粗磨石(或磨砂玻璃板)上,加适量水,用食指、中指夹住或压住材料,在磨石上往返磨砺,待两面磨平,且厚度约数百微米时,将材料移置细磨石上,加水,用软木塞压在材料上,往返磨砺至透明,用水冲洗,再用乙醇处理和甘油乙醇试液装片。

  二、含饮片粉末的制剂显微制片

  按供试品不同剂型,散剂、胶囊剂(内容物为颗粒状,应研细),可直接取适量粉末;片剂取2~3片,水丸、糊丸、水蜜丸、锭剂等(包衣者除去包衣),取数丸或1~2锭,分别置乳钵中研成粉末,取适量粉末;蜜丸应将药丸切开,从切面由外至中央挑取适量样品或用水脱蜜后,吸取沉淀物少量。根据观察对象不同,分别按粉末制片法制片(1~5片)。

  三、细胞壁性质的鉴别

  1.木质化细胞壁   加间苯三酚试液1~2滴,稍放置,加盐酸1滴,因木质化程度不同,显红色或紫红色。

  2.木栓化或角质化细胞壁   加苏丹Ⅲ试液,稍放置或微热,显橘红色至红色。

  3.纤维素细胞壁   加氯化锌碘试液,或先加碘试液湿润后,稍放置,再加硫酸溶液(33→50),显蓝色或紫色。

  4.硅质化细胞壁   加硫酸无变化。

  四、细胞内含物性质的鉴别

  1.淀粉粒

  (1)加碘试液,显蓝色或紫色。

  (2)用甘油醋酸试液装片,置偏光显微镜下观察,未糊化的淀粉粒显偏光现象;已糊化的无偏光现象。

  2.糊粉粒

  (1)加碘试液,显棕色或黄棕色。

  (2)加硝酸汞试液,显砖红色。材料中如含有多量脂肪油,应先用乙醚或石油醚脱脂后进行试验。

  3.脂肪油、挥发油、树脂

  (1)加苏丹Ⅲ试液,显橘红色、红色或紫红色。

  (2)加90%乙醇,脂肪油和树脂不溶解(蓖麻油及巴豆油例外),挥发油则溶解。

  4.菊糖   加10%α-萘酚乙醇溶液,再加硫酸,显紫红色并溶解。

  5.黏液  加钌红试液,显红色。

  6.草酸钙结晶

  (1)加稀醋酸不溶解,加稀盐酸溶解而无气泡发生。

  (2)加硫酸溶液(1→2)逐渐溶解,片刻后析出针状硫酸钙结晶。

  7.碳酸钙结晶(钟乳体)   加稀盐酸溶解,同时有气泡发生。

  8.硅质   加硫酸不溶解。

  五、显微测量

  系指用目镜测微尺,在显微镜下测量细胞及细胞内含物等的大小。

  1.目镜测微尺   放在目镜筒内的一种标尺,为一个直径18~20mm的圆形玻璃片,中央刻有精确等距离的平行线刻度,常为50格或100格(图1)。

  2.载物台测微尺   在特制的载玻片中央粘贴一刻有精细尺度的圆形玻片。通常将长1mm(或2mm)精确等分成100(或200)小格,每1小格长为10μm,用以标定目镜测微尺(图2)。

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  3.目镜测微尺的标定   用以确定使用同一显微镜及特定倍数的物镜、目镜和镜筒长度时,目镜测微尺上每一格所代表的长度。

  取载物台测微尺置显微镜载物台上,在高倍物镜(或低倍物镜)下,将测微尺刻度移至视野中央。将目镜测微尺(正面向上)放入目镜镜筒内,旋转目镜,并移动载物台测微尺,使目镜测微尺的“0"刻度线与载物台测微尺的某刻度线相重合,然后再找第二条重合刻度线,根据两条重合线间两种测微尺的小格数,计算出目镜测微尺每一小格在该物镜条件下相当的长度(μm),如图3所示,目镜测微尺77个小格(0~77)与载物台测微尺的30个小格(0.7~1.0)相当,已知载物台测微尺每一小格的长度为10μm。目镜测微尺每一小格长度为:10μm×30÷77=3.8μm。

  当测定时要用不同的放大倍数时,应分别标定。

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  4.测量方法   将需测量的目的物显微制片置显微镜载物台上,用目镜测微尺测量目的物的小格数,乘以上述每一小格的微米数。通常是在高倍镜下测量,但欲测量较长的目的物,如纤维、导管、非腺毛等的长度时,需在低倍镜下测量。记录最大值与最小值(μm),允许有少量数值略高或略低于规定。


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