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细菌DNA特征序列鉴定法 中国药典2020版四部通则1021

中国药典2020版四部通则1021

细菌DNA特征序列鉴定法


  细菌DNA特征序列鉴定法系以特征核酸序列作为目标检测物,用于药用原料、辅料、制药用水、中间产品、终产品、包装材料和环境等药品全生命周期质量控制中细菌的鉴定。

  本法通过对细菌16S核糖体RNA(16S  ribosomal  RNA gene,16S  rRNA)基因特征序列的测定,实现细菌的生物学鉴定。细菌16S rRNA基因全长约1500bp,包含9个可变区(VarIable  region,V区)和10个恒定区(Constant  region,C区),在结构与功能上具有高度保守性,是细菌分类和鉴定中得到广泛应用的DNA特征序列之一。

  

  实验环境和仪器的一般要求

  

  开展细菌鉴定试验的环境应具备分子生物学实验室的基本条件,并符合相应级别的生物安全要求。

  所用仪器有电子天平、离心机、冰箱、恒温仪、DNA定量仪器(如紫外或荧光分光光度仪),聚合酶链式反应(polymerase  chain  reaction,PCR)分析仪、电泳仪、凝胶成像仪、核酸测序仪等。

  

  试剂及其制备方法

  

  三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸二钠缓冲液(TE缓冲液,pH8.0)  称取三羟甲基氨基甲烷12.1g,加适量水搅拌溶解,并稀释至100ml,用盐酸试液调节pH值至8.0,得到1mol/L贮备液;称取乙二胺四乙酸二钠18.6g,加适量水搅拌溶解,并稀释至100ml,用氢氧化钠试液调节pH值至8.0,得到0.5mol/L贮备液。取三羟甲基氨基甲烷贮备液10ml,乙二胺四乙酸二钠贮备液2ml,加水稀释至1000ml,灭菌。

  PCR反应缓冲液(pH8.3)  称取三羟甲基氨基甲烷12.1g,氯化钾37.3g,氯化镁2.4g,加适量水搅拌溶解,并稀释至1000ml,用盐酸试液调节pH值至8.3,灭菌。

  电泳缓冲液(TAE缓冲液,pH8.0)  称取三羟甲基氨基甲烷4.84g,冰乙酸1.14ml,乙二胺四乙酸二钠0.75g,加适量水搅拌溶解,并稀释至1000ml,用氢氧化钠试液调节pH值至8.0。

  上样缓冲液  称取溴溴酚蓝0.25g,二甲苯氰0.25g,蔗糖40.0g,加适量水搅拌溶解,并稀释至100ml。

  核酸的提取、扩增、产物检测和纯化等也可以采用适宜的商品化试剂和试剂盒。

  

  方法适用性试验

  

  细菌DNA特征序列鉴定时,应进行方法适用性试验,以确认所采用的方法适合于目标菌的鉴定。若鉴定条件发生变化可能影响鉴定结果时,应重新进行方法适用性试验。

  进行方法适用性试验时,选择革兰阳性和阴性标准菌株按“待检菌的测定”步骤进行操作。提取的核酸质量应能满足核酸扩增的要求;核酸扩增产物应能在500bp左右检测到一条目的条带;核酸测序结果应与相应对照菌株的核酸序列一致。

  方法适用性试验应设定阴性对照试验,取灭菌的纯化水作为阴性对照,照核酸提取及后续步骤进行操作。核酸扩增产物应无扩增条带。

  方法适用性试验可与待检菌的测定同时进行。

  

  待检菌的测定

  

  待检菌的测定应设置阳性对照试验和阴性对照试验。

  阳性对照试验

  根据待检菌的革兰染色等特性,选择特征序列确定的菌株作为阳性对照菌,照待检菌的测定步骤进行操作。阳性对照试验提取的核酸质量应能满足核酸扩增的要求;核酸扩增产物应能在500bp左右检测到一条目的条带;核酸测序结果应与相应对照菌株的核酸序列一致。

  阴性对照试验

  取灭菌的纯化水作为阴性对照,照核酸提取及后续步骤进行操作,用以确证核酸提取、PCR反应体系和扩增过程无污染。阴性对照试验的核酸扩增产物应无扩增条带。

  待检菌测定

  (1)分离纯化   挑取待检菌在适宜的固体培养基上连续划线培养,以获取纯培养物(单个菌落)。

  (2)核酸提取   核酸提取常用十六烷基三甲溴化铵(cetyltrimethylammonium  bromide  method,CTAB)法,也可采用十二烷基硫酸钠法、碱裂解法等其他适宜的方法,必要时加入核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)去除RNA。

  CTAB法提取核酸的一般步骤   取适量经分离纯化后的

  待测菌纯培养物于离心管中,加入TE缓冲液450μl、溶菌酶(10mg/ml)25μl,混匀,置37℃水浴加热30分钟;加入10%十二烷基硫酸钠溶液50μl,混匀,置37℃水浴加热15分钟;加入1%氯化钠溶液80μl、10%CTAB溶液70μl,混匀,置65℃水浴加热15分钟;加入饱和苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1,ml/m1)溶液350μl,剧烈振荡,室温静置5分钟,离心(转速为每分钟12000转)10分钟,取上清液置于新的离心管中,重复操作1次;加入2倍体积无水乙醇,于-20℃静置不少于30分钟,离心(转速为每分钟12000转)10分钟,弃去上清液;加入适量75%乙醇溶液洗涤,离心(转速为每分钟12000转)10分钟,弃去上清液,室温风干至乙醇挥发完全;加入适宜体积的TE缓冲液溶解,作为核酸提取溶液(模板DNA),置2~8℃冰箱中备用。

  待检菌提取的核酸质量应能满足核酸扩增的要求,核酸浓度宜不低于10ng/μl。模板DNA浓度和纯度测定常用紫外分光光度法,A260/A280比值宜在1.8~2.0之间。

  (3)核酸扩增  本法中的核酸扩增是指对16S rRNA基因VI~V3可变区核酸序列片段进行扩增,其扩增引物、反应体系及扩增程序如下:

  扩增引物  正向引物(16SV1F):5'-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3';

  反向引物(16SV3R):5'-GTATTACCGCGGCTGCTGGC-3'。

  反应体系  常用的PCR反应体系为25μl。制备时,取PCR反应缓冲液2.5μl,脱氧核糖核苷三磷酸(2.5mmol/L)2μl,正向和反向引物(2.5μmol/L)各2μl,模板DNA 1μl,Taq DNA聚合酶(1U/μl)1μl,加灭菌的纯化水至25μl。

  扩增程序  采用的扩增程序为:94℃预变性3分钟;94℃变性30秒,55~60℃退火30秒,72℃延伸60秒,30个循环;72℃继续延伸5分钟。

  (4)核酸扩増产物的检测  采用琼脂糖凝胶电泳法检测核酸扩增产物。使用电泳缓冲液配制1.5%琼脂糖凝胶,其中加入溴化乙锭或吖啶橙等适宜的核酸凝胶染色剂。取核酸扩增产物5μl、上样缓冲液1μl,混匀后上样,于100~150V电压下电泳,溴酚蓝条带移动至凝胶片的1/2~2/3处结束电泳。取凝胶片在紫外凝胶成像仪上检视,核酸扩增产物应在约500bp的位置出现一条目的条带。核酸扩增产物检测时应选择适宜的DNA分子量标记,目的条带的大小应包括在DNA分子量标记的范围内。

  (5)核酸扩增产物的纯化  核酸扩增产物应进行纯化,去除扩增引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶等残留。核酸扩增产物纯化的主要步骤包括:将琼脂糖凝胶中的核酸扩增产物切下,置于离心管中,加入适量体积的TE缓冲液,65~95℃水浴至凝胶块完全溶解;分别加入1/10体积乙酸钠溶液(3mol/L,pH5.2)和乙二胺四乙酸钠溶液(125mmol/L,pH8.0),混匀;加入2倍体积无水乙醇,-20℃静置30分钟;离心(转速为每分钟12000转)10分钟,弃去上清液;加入适量75%乙醇溶液洗涤,离心(转速为每分钟12000转)10分钟,弃去上清液,室温风干至乙醇挥发完全;加入适宜体积的TE缓冲溶液溶解,作为核酸扩增产物的纯化溶液,置2~8℃冰箱中备用。

  (6)核酸测序 以扩增引物作为测序引物,使用核酸测序仪对纯化后的核酸扩增产物进行双向测序,获得目标核酸序列。对核酸测序结果进行序列质量核查。双向测序峰图应采用有峰图拼接功能的软件,以正、反向核酸序列叠加的方式进行序列拼接,并去除两端引物区序列。拼接后得到的核酸序列方向应与核酸扩增正向引物方向一致。

  (7)结果判定  将获得的细菌DNA特征序列与经验证过的专用数据库进行比对。根据比对结果进行判定。


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