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细菌生化反应培养基 中国药典2020版四部通则3605

中国药典2020版四部通则3605

细菌生化反应培养基


  下列各类培养基常用于测定细菌的糖类代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试验、碳源和氮源利用试验等生化反应。

  1.糖、醇发酵培养基

  (1)成分

  基础液

  蛋白胨                                                                                              10g

  氯化钠                                                                                                5g

  0.5%酸性品红指示液                                                                            10ml

  (或0.4%溴麝香草酚蓝指示液)                                                    (6ml)

  水                                                                                                1000ml

  糖、醇类                                                             每100ml基础液内各加0.5g

  (2)制法 取蛋白胨和氯化钠加入水中,微温使溶解,调pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入指示液混匀。每100ml分别加入1种糖、醇或糖苷,混匀后分装于小管中(若需观察产气反应,在小管内另放置杜汉小倒管)。于116℃灭菌15分钟。

  常用的糖、醇或糖苷:阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、蕈糖、纤维二糖、蜜二糖、棉子糖、松三糖、菊糖、糊精、淀粉、甘露醇、卫矛醇、山梨醇、肌醇、甘油、水杨素、七叶苷等。

  (3) 用途 鉴别各种细菌对糖类的发酵生化反应,发酵者产酸,培养基变色(加酸性品红者由无色至红色或再至黄色;加溴麝香草酚蓝者由蓝色至黄色);产气时,小倒管内有小气泡。

  2.七叶苷培养基

  (1)成分

  蛋白胨         5g 七叶苷 3g

  磷酸氢二钾 1g 1000ml

  枸橼酸铁 0.5g

  (2)制法 除七叶苷外,取上述成分混合,微温使溶解,加入七叶苷混匀,调pH值使灭菌后为7.3±0.1,分装于试管中,121℃灭菌15分钟。

  (3)用途 用于鉴别细菌对七叶苷的水解试验,产生棕黑色沉淀为阳性反应。

  3.磷酸盐葡萄糖胨水培养基

  (1)成分

  蛋白胨        7g   葡萄糖 5g

  磷酸氢二钾 3.8g水 1000ml

  (2)制法 取上述成分混合,微温使溶解,调pH值使灭菌后为7.3±0.1,分装于小试管中,121℃灭菌15分钟。

  (3)用途 用于鉴别细菌的甲基红试验(M-R反应)和乙酰甲基甲醇试验(V-P反应)。

  ①甲基红试验(M-R反应) 取可疑菌落或斜面培养物,接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中,置35℃培养2~5天,于培养管内加入甲基红指示液(称取甲基红0.1g,加95%乙醇300ml,使溶解后,加水至500ml)数滴,立即观察,呈鲜红色或橘红色为阳性,呈黄色为阴性。

  ②乙酰甲基甲醇生成试验(V-P反应) 取可疑菌落或斜面培养物,接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中,置35℃培养48小时,量取2ml培养液,加入α-萘酚乙醇试液(称取α-萘酚5g,加无水乙醇溶解使成100ml)1ml,混匀,再加40%氢氧化钾溶液0.4ml,充分振摇,立刻或数分钟内出现红色,即为阳性反应;无红色反应为阴性,如为阴性反应,置35℃水浴4小时后再观察。

  4.蛋白胨水培养基

  (1)成分

  蛋白胨 10g 1000ml

  氯化钠 5g

  (2)制法 取上述成分混合,微温使溶解,调pH值使灭菌后为7.3±0.1,分装于小试管,121℃灭菌15分钟。

  (3)用途 用于鉴别细菌能否分解色氨酸而产生靛基质的生化反应。

  ①靛基质试验 取可疑菌落或斜面培养物,接种于蛋白胨水培养基中,置35℃培养24~48小时,必要时培养4~5天,沿管壁加入靛基质试液数滴,液面呈玫瑰红色为阳性,呈试剂本色为阴性。

  ②靛基质试液 称取对二甲氨基苯甲醛5g,加入戊醇(或异戊醇)75ml,充分振摇,使完全溶解后,再取盐酸25ml徐徐滴入,边加边振摇,以免骤热导致溶液色泽变深。或称取对二甲氨基苯甲醛1g,加入95%乙醇95ml,充分振摇,使完全溶解后,再取盐酸20ml徐徐滴入。

  5.三糖铁琼脂培养基

  (1)成分

  蛋白胨        20g 硫酸亚铁    0.2g

  牛肉浸出粉 5g 硫代硫酸钠 0.2g

  乳糖     10g 0.2%酚磺酞指示液 12.5ml

  蔗糖  10g 琼脂                        12~15g

  葡萄糖 1g                      1000ml

  氯化钠 5g

  (2)制法 除乳糖、蔗糖、葡萄糖、指示液、琼脂外,取上述成分,混合,加热使溶解,调pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入琼脂,加热溶胀后,再加入其余成分,摇匀,分装,121℃灭菌15分钟,制成高底层(2~3cm)短斜面。

  (3)用途 用于初步鉴别肠杆菌科细菌对糖类的发酵反应和产生硫化氢试验。

  方法和结果观察:取可疑菌落或斜面培养物,做高层穿刺和斜面划线接种,置35℃培养24~48小时,观察结果。培养基底层变黄色为葡萄糖发酵阳性,斜面层变黄色为乳糖、蔗糖发酵阳性;底层或整个培养基呈黑色表示产生硫化氢。

  6.克氏双糖铁琼脂培养基

  (1)成分

  蛋白胨        20g 枸橼酸铁 0.3g

  牛肉浸出粉 3g 硫代硫酸钠 0.3g

  酵母浸粉      3g 0.2%酚磺酞指示液 12.5ml

  乳糖               10g 琼脂         12~15g

  葡萄糖        1g        1000ml

  氯化钠 5g

  (2)制法 除乳糖、葡萄糖、指示液、琼脂外,取上述成分,混合,加热使溶解,调pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入琼脂,加热溶胀后,再加入其余成分,摇匀,分装,121℃灭菌15分钟,制成高底层(2~3cm)短斜面。

  (3)用途 用于初步鉴别肠杆菌科细菌对糖类的发酵反应和产生硫化氢试验。

  方法和结果观察:取可疑菌落或斜面培养物,做高层穿刺和斜面划线接种,置35℃培养24~48小时,观察结果。培养基底层变黄色为葡萄糖发酵阳性,斜面层呈黄色为乳糖发酵阳性,斜面层呈红色为乳糖发酵阴性;底层或整个培养基呈黑色表示产生硫化氢。

  7.脲(尿素)培养基

  (1)成分

  蛋白胨 1g 0.2%酚红溶液 6ml

  葡萄糖 1g 20%无菌脲溶液100ml

  氯化钠 5g 1000ml

  磷酸氢二钾 2g

  (2)制法 除脲溶液外,取上述成分,混合,调pH值使灭菌后为6.9±0.1,混匀后,121℃灭菌15分钟,冷至50~55℃,加入无菌脲溶液(经膜除菌过滤),混匀,分装于灭菌试管中。

  (3)用途 用于鉴别细菌的尿素酶反应。

  方法和结果观察:取可疑菌落或少量斜面培养物接种于培养基内,置35℃培养24小时,观察结果。培养基变为红色为尿素酶反应阳性;不变色为阴性,阴性者需延长观察至1周。

  8.苯丙氨酸琼脂培养基

  (1)成分

  磷酸氢二钠 1g 氯化钠 5g

  酵母浸膏    3g 琼脂 12~15g

  DL-苯丙氨酸(DL-phenylalanine) 2g 1000ml

  (或L-苯丙氨酸) (1g)

  (2)制法 除琼脂外,取各成分溶于水,调pH值使灭菌后为7.3±0.1,再加入琼脂,加热溶胀,分装试管,121℃灭菌15分钟,制成长斜面。

  (3)用途 用于鉴别细菌的苯丙氨酸脱氨酶试验(也称苯丙酮酸试验)。

  方法和结果观察:取斜面培养物,大量接种于苯丙氨酸琼脂斜面,置35℃培养4小时或18~24小时,取4~5滴10%三氯化铁溶液试剂,由斜面上部流下,若出现墨绿色,即为苯丙氨酸脱氨酶试验阳性;倘若不变色则为阴性。

  9.氨基酸脱羧酶试验培养基

  (1)成分

  ①基础液

  蛋白胨 5g 1.6%溴甲酚紫指示液 1ml

  酵母浸出粉 3g 1000ml

  葡萄糖 1g

  ②氨基酸

  L-赖氨酸 0.5g (需加碱溶液溶解)

  L-鸟氨酸 0.5g (需加碱溶液溶解)

  L-精氨酸 0.5g (不需加碱溶液溶解)

  (2)制法 先配制基础液备用;将溶解后的3种氨基酸,各分别加至100ml基础液(使氨基酸的终浓度为0.5%),混匀,调pH值使灭菌后为6.8。分装于小试管中,每管2.5ml并滴加1层液状石蜡;同时分装一部分基础液于小试管,作为对照培养基,均置116℃灭菌10分钟。

  (3)用途 用于鉴别细菌的脱羧酶、双水解酶试验。

  方法和结果观察:取疑似菌斜面培养物分别接种于上述3种培养基及基础液对照培养基,置35C培养24~48小时。在培养初期由于待检细菌发酵葡萄糖产酸,试验培养基和对照培养基应呈黄色,继续培养时,试验培养基如呈紫色或紫红色,即为阳性反应;如至培养末期,培养基仍同对照管呈黄色,则判为阴性反应。

  10.明胶培养基

  (1)成分

  蛋白胨 5g 明胶 120g

  牛肉浸出粉     3g 1000ml

  (2)制法 取上述成分加入水中,浸泡约20分钟,加热溶解,调pH值使灭菌后为7.3±0.1,分装于小试管中,121℃灭菌15分钟。

  (3)用途 用于细菌的明胶液化试验。

  方法和结果观察:取少量待检菌斜面培养物穿刺接种于明胶培养基内,置35℃培养24小时,取出置冰箱内10~20分钟。如培养基仍呈溶液状,则为阳性;培养基重新凝固,则为阴性。细菌液化明胶之作用有时甚为缓慢,如未见液化,需继续培养1~2周方可确定阴性。

  11.丙二酸钠培养基

  (1)成分

  酵母浸出粉 1g 磷酸二氢钾 0.4g

  氯化钠 2g 丙二酸钠 3g

  葡萄糖 0.25g 0.4%溴麝香草酚蓝指示液 6ml

  硫酸铵 2g 1000ml

  磷酸氢二钾 0.6g

  (2)制法 除指示液外,将上述成分溶解,调pH值使灭菌后为6.8,再加入指示液。分装小管中,121℃灭菌15分钟。

  (3)用途 用于鉴别细菌能否利用丙二酸钠作为碳源而生长繁殖。

  方法和结果观察:取斜面或肉汤培养物接种于丙二酸钠培养基内,置35℃培养48小时。于24小时和48小时后各观察1次结果。培养基颜色由绿色变成蓝色为阳性反应;无颜色变化,或由绿色变成黄色,则为阴性反应。

  12.枸橼酸盐培养基

  (1)成分

  氯化钠 5g 枸橼酸钠(无水) 2g

  硫酸镁 0.2g 1.0%溴麝香草酚蓝指示液 10ml

  磷酸氢二钾 1g 琼脂 14g

  磷酸二氢铵 1g 1000ml

  (2)制法 除指示液和琼脂外,取上述成分,混合,微温使溶解,调pH值使灭菌后为6.9±0.1,加入琼脂,加热溶胀,然后加入指示液,混匀,分装于小试管中,121℃灭菌15分钟,制成斜面。

  (3)用途 用于鉴别细菌能否利用枸橼酸盐作为碳源和氮源而生长繁殖。

  方法和结果观察:取可疑菌落或斜面培养物,接种于枸橼酸盐培养基的斜面上,一般培养48~72小时,凡能在培养基斜面生长出菌落,培养基即由绿色变成蓝色者为阳性反应;无菌落生长,培养基仍绿色者为阴性反应,阴性反应者应继续培养观察至7天。

  13.硝酸盐胨水培养基

  (1)成分

  蛋白胨 10g 硝酸钾 2g

  酵母浸出粉3g 1000ml

  (2)制法 取上述成分,加热溶解,调pH值使灭菌后为7.3±0.1,分装于小试管中,121℃灭菌15分钟。

  (3)用途 用于鉴别细菌能否还原硝酸盐成亚硝酸盐。

  方法和结果观察:取待检菌培养物接种于硝酸盐胨水培养基中,置35℃培养24小时。将下列甲液和乙液于用前等量混合,每个培养物加混合物0.1ml,产生红色为阳性反应,不产生红色为阴性反应。

  甲液:称取α-萘胺5g,溶解于5mol/L醋酸1000ml中。

  乙液:称取磺胺酸(对氨基苯磺酸)8g,溶解于5mol/L醋酸1000ml中。

  14.石蕊牛奶培养基

  (1)成分

  脱脂奶粉 10g 水100ml

  10%石蕊溶液 0.65ml

  (2)制法 取上述成分混匀后,分装于小试管中,116℃灭菌10分钟。

  (3)用途 用于检查细菌对牛奶的凝固和发酵作用。

  15.半固体营养琼脂培养基

  (1)成分

  蛋白胨 10g 琼脂 4g

  牛肉浸出粉 3g 1000ml

  氯化钠 5g

  (2)制法 除琼脂外,取上述成分,混合,微温使溶解,调pH值使灭菌后为7.2±0.2,再加入琼脂,加热溶胀,分装于小管中,121℃灭菌15分钟后,直立放置。待凝固后备用。

  (3)用途  用于观察细菌的动力,也可用于一般菌种的保存。

  细菌动力检查:取疑似菌斜面培养物穿刺接种于半固体营养琼脂培养基中,置35℃培养24小时,细菌沿穿刺外周扩散生长,为动力阳性;否则为阴性。阴性者,应再继续培养观察2~3天。


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