苦瓜种子源凝集素
苦瓜种子源凝集素
凝集素是糖和糖链结合的蛋白，广泛存在于动物、植物和微生物中。至今拥有多种结构和糖链特异性的凝集素大多数已被分离，各种功能已有文献报告，例如免疫细胞或癌细胞的转移、细菌和病毒的感染通路都与凝集素相关。另一方面糖链也与细胞间粘附、细胞间交流、过敏等各种生理功能相关，正常细胞癌变时细胞表面的糖链也会发生变化。我们对基因、蛋白的功能了解比较深，但对糖链本身的功能却有很多不清楚的地方，在糖链的多样性、合成和分析等方面仍有研究难点。在糖链研究的领域里，凝集素是研究糖链特异性及多样性的分析工具。研究人员一直在分离动物、植物、微生物中的新型凝集素用于糖链功能分析。
我们和宫崎大学共同进行研究，分离纯化出苦瓜种子源凝集素，本文就该糖链的特异性及应用例子进行了介绍。
◆苦瓜种子源凝集素
苦瓜（学名：Momordica charantia）在日本主要种植于九州、冲绳等地，是一种味苦的食用蔬菜，因生长旺盛，也会用作植物窗帘。受近年的健康热潮影响，苦瓜的营养价值和预防生活习惯病的优点十分引人注目。苦瓜的种子也有健康功能性成分，目前一般制成苦瓜茶，大部分情况下都只能被抛弃，我们期待能更好地利用苦瓜种子。
本产品是从苦瓜种子中分离的对H抗原有高亲和性的凝集素。基因克隆后进行氨基酸序列测序，发现该凝集素是分子量约为61,000 kDa的蛋白，在还原条件下进行SDS-PAGE，结果形成4异源二聚体（图1）。经蛋白结构域分析，该凝集素的核糖体失活蛋白样区域（RIP域）和蓖麻（Ricinus communis）源凝集素家族区域（Ricin B lectin域），有蛋白转录抑制的作用。
◆糖链特异性
该凝集素具单糖特异性，对D-半乳糖有亲和性。血液凝集抑制试验的结果是，该凝集素对H抗原二糖（Fuc α1-2Gal）、D-乳糖（Galβ 1-4Glc）、N-乙酰基-D-乳糖（Galβ1-4GlcNAc）、乳酸-N-二糖I（Galβ1-3GlcNAc）等含有半乳糖的二糖有高亲和性，特别是对H抗原三糖（Fucα1-2Gal β1-4GlcNAc）有非常高的亲和性（表1）。根据这个特性，该凝集素可在血型鉴定中判断H抗型（A1、A2、B和O型）和H抗原缺陷型（Omh型）（图2）。该凝集素热稳定性好， 55℃下处理15分钟也可发挥血液凝集活性。
表1、各种糖类的最低凝集抑制浓度1）
糖链2）
最低抑制浓度（mM）
抑制比（D-Gal=1.0）
D-Gal（D-半乳糖）
12.5
1.0
GalNAc（N-乙酰基-D-半乳糖胺）
12.5
1.0
Me-α-D-Gal（甲基-α-D-吡喃半乳糖苷）
12.5
1.0
Galβ1-4Glc（D-乳糖）
3.1
4.0
Galβ1-4GlcNAc（N-乙酰基-D-乳糖）
3.1
4.0
Galβ1-3GlcNAc（乳酸-N-二糖I）
6.3
2.0
Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAc（Lewisb抗原三糖）
25.0
0.5
Fucα1-2Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAc（Lewisb抗原四糖）
12.5
1.0
GalNAcα1-3（Fucα1-2）Gal（A抗原三糖）
25.0
0.5
Galα1-3（Fucα1-2）Gal（B抗原三糖）
100.0
0.1
Fucα1-2Gal（H抗原二糖）
3.1
4.0
Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc（H抗原三糖）
0.1
125.0
1）苦瓜凝集素（0.02μg/ml）对人O型红血球的凝集反应的最低抑制浓度
2）100mM浓度下不能抑制凝集素的糖：L-Fuc、D-Man、D-Frc、蔗糖，葡萄糖，N，N-diacetylchitobiose，N-乙酰神经氨酸
◆糖蛋白特异性
检测苦瓜凝集素亲和柱和糖蛋白的结合性，结果表明凝集素亲和柱虽然没有吸附胎球蛋白的活性，但对无唾液酸胎球蛋白（用唾液酸酶处理去除胎球蛋白末端的唾液酸的糖蛋白）有吸附活性（表2）。这表明，该凝集素可用来检测拥有乳糖糖链的糖蛋白和H抗原。
表2 苦瓜凝集素亲和柱对各种糖蛋白的吸附
糖蛋白
吸附
无唾液酸胎球蛋白
+++
大豆凝集素
+
甲状腺球蛋白
±
粘蛋白
±
辣根过氧化物酶
±
白蛋白
–
卵清蛋白
–
Α1-酸性糖蛋白
–
纤维蛋白原
–
胰凝乳蛋白酶原A
–
IgG
–
Holo-transferrin
–
胎球蛋白
–
◆组织染色
使用生物素标记的凝集素，对大鼠消化道进行组织染色，其中上消化道（胃、十二指肠、空肠、回肠）的粘液细胞里有阳性反应，下消化道里近端结肠的一部分粘液细胞有选择性的阳性反应，远端结肠则呈阴性（图3）。近端结肠里产生选择性阳性反应是该凝集素特有。在脑、心脏、肾脏等主要器官里，该凝集素也有结合性。
◆免疫活性化效果
为了研究该凝集素的佐剂效果，我们把用β-半乳糖苷酶作为模型抗原用于BALB/c小鼠作为对照，另一边则是β-半乳糖苷酶和苦瓜种子源凝集素联合给药。结果，只使用β-半乳糖苷酶与联合给药相比，后者的抗原特异性IgG抗体效价显著提高。除此之外，进行了纯化苦瓜种子源凝集素与小鼠淋巴细胞的结合性和增殖活性的检测，发现它与B细胞特异性结合，并显示出增殖活性。因此，该凝集素可以成为B细胞的特异性活化剂。
参考文献
１） Sharon, N.、Lis, H. 著/山本一夫、小浪悠紀子訳:「レクチン第2 版」（丸善出版）（2006）.
２） Huang, L. et al . : Immunol. Lett ., 121（2）,148-156（2008）.
３） Huang, L. et al . : J. Vel. Med. Sci ., 70（5）,533-535（2008）.
４） Tanaka, H. et al . : Asian J. Plant Sci ., 8（8）,544-550（2009）.
５） Toyama, J. et al . : Asian J. Plant Sci ., 7（7）,647-653（2008）.