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人胰岛素

Ren Yidaosu

Human Insulin

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  分子式:C257H383N65O77S6分子量:5807.69Da

  本品系由含有可高效表达人胰岛素基因的工程化细胞,经发酵、分离、高度纯化、结晶和干燥制成的原料药。人胰岛素为51个氨基酸残基组成的蛋白质。按干燥品计算,含人胰岛素(包括A21脱氨人胰岛素)应为95.0%~105.0%。

  每1单位人胰岛素相当于0.0347mg。

  1  基本要求

  生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具等应符合“凡例”的有关要求。

  2  制造

  2.1  工程菌

  工程菌菌种名称、来源及种子批检定应符合批准的要求。

  2.2  原料

  2.2.1  种子液制备

  将检定合格的工作种子批细胞接种于适宜的培养基(可含适量抗生素)中培养。

  2.2.2  发酵用培养基

  采用适宜的不含抗生素的培养基。

  2.2.3  种子液接种及发酵培养

  2.2.3.1  在灭菌培养基中接种适量种子液。

  2.2.3.2  应根据经批准的工艺进行发酵,并确定相应的发酵条件,如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。如系大肠埃希菌表达,发酵液应定期进行质粒丢失率检查(通则3406)。

  2.2.4  发酵液处理

  用适宜的方法收集、处理细胞。

  2.2.5  初步纯化及高度纯化

  釆用经批准的纯化工艺进行初步纯化和高度纯化,使其纯度达到规定的要求。

  2.2.6  过滤、结晶及干燥

  经初步纯化和高度纯化后,釆用经批准的结晶工艺及干燥工艺对纯化收集物进行过滤、结晶和干燥,干燥品即为人胰岛素原料药。

  2.2.7  分批

  应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

  2.2.8  包装

  应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。

  3  检定

  3.1  性状

  本品为白色或类白色粉末。

  3.2  鉴别

  3.2.1  在含量测定项下记录的色谱图中,供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。

  3.2.2  取本品适量,用0.1%三氟乙酸溶液制成每1ml中含10mg的溶液,取20μl,加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.3)20μl、0.1%V8酶溶液20μl与水140μl,混匀,置37℃水浴中2小时后,加磷酸3μl,作为供试品溶液;另取人胰岛素对照品适量,同法制备,作为对照品溶液。照含量测定项下的色谱条件,以0.2mol/L硫酸盐缓冲液(pH2.3)-乙腈(90∶10)为流动相A、乙腈-水(50∶50)为流动相B,按下表进行梯度洗脱。取对照品溶液和供试品溶液各25μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,片段Ⅱ与片段Ⅲ之间的分离度应不小于3.4,片段Ⅱ与片段Ⅲ的拖尾因子应不大于1.5。供试品溶液的肽图谱应与对照品溶液的肽图谱一致。

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  3.3  检查

  3.3.1  有关物质

  取本品适量,用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中含3.5mg的溶液,作为供试品溶液。照含量测定项下的方法,以0.2mol/L硫酸盐缓冲液(pH2.3)-乙腈(82∶18)为流动相A、乙腈-水(50∶50)为流动相B,按下表进行梯度洗脱。调节流动相比例使人胰岛素主峰的保留时间约为25分钟,系统适用性试验应符合含量测定项下的规定。取供试品溶液20μl注入液相色谱仪,记录色谱图,按峰面积归一化法计算,A21脱氨人胰岛素不得过1.5%;其他杂质峰面积之和不得过2.0%。

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  3.3.2  高分子蛋白质

  取本品适量,用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含4mg的溶液,作为供试品溶液。照分子排阻色谱法(通则0514)试验。以亲水改性硅胶为填充剂(5~10μm);以冰醋酸-乙腈-0.1%精氨酸溶液(15∶20∶65)为流动相,流速为每分钟0.5ml,检测波长为276nm。取人胰岛素单体-二聚体对照品,用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中含4mg的溶液;取100μl注入液相色谱仪,人胰岛素单体峰与二聚体峰的分离度应符合要求。取供试品溶液100μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,除去保留时间大于人胰岛素主峰的其他峰面积;按峰面积归一化法计算,保留时间小于人胰岛素主峰的所有峰面积之和不得大于1.0%。

  3.3.3  锌

  精密称取本品适量,加0.01mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液。另精密量取锌单元素标准溶液(每1ml中含锌1000μg)适量,用0.01mol/L的盐酸溶液分别定量稀释成每1ml含锌0.2μg、0.4μg、0.6μg、0.8μg及1.0μg的锌标准溶液,照原子吸收分光光度法(通则0406第一法),在213.9nm的波长处分别测定吸光度,按干燥品计,含锌量不得大于1.0%。

  3.3.4  干燥失重

  取本品0.2g,在105℃干燥至恒重,减失重量不得过10.0%(通则0831)。

  3.3.5  炽灼残渣

  取本品约0.2g,依法检查(通则0841),遗留残渣不得过2.0%。

  3.3.6  微生物限度

  取本品0.3g,照非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法(通则1105),每1g供试品中需氧菌总数不得过300cfu。

  3.3.7  细菌内毒素

  取本品,依法检查(通则1143),每1mg人胰岛素中含内毒素的量应小于10EU。

  3.3.8  宿主蛋白残留量

  取本品适量,依法检查(通则3412或3414),或釆用经验证并批准的适宜方法检查,每1mg人胰岛素中宿主蛋白残留量不得过10ng。

  3.3.9  宿主DNA残留量

  取本品适量,依法检查(通则3407),或采用经验证并批准的适宜方法检查,每1.5mg人胰岛素中宿主DNA残留量不得过10ng。

  3.3.10  抗生素残留量

  如生产(例如种子液制备)中使用抗生素,应依法检查(通则3408),或釆用经批准的方法检查,不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。

  3.3.11  生物学活性(至少每年测定一次)

  取本品适量,照胰岛素生物测定法(通则1211),每组的实验动物数可减半,实验釆用随机设计,照生物检定统计法(通则1431)中量反应平行线测定随机设计法计算效价,每1mg人胰岛素的效价不得少于15单位。

  3.3.12  N末端氨基酸序列(至少每年测定一次)

  取本品,采用氨基酸序列分析仪或其他适宜的方法测定。

  A链N末端15个氨基酸序列:

  Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln;

  B链N末端15个氨基酸序列:

  Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu。

  3.3.13  单链前体

  工艺中如有单链前体,应采用经批准的方法及限度进行控制。

  3.4  含量测定

  照高效液相色谱法(通则0512)测定。

  色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(5~10μm),0.2mol/L硫酸盐缓冲液(取无水硫酸钠28.4g,加水溶解后,加磷酸2.7ml、水800ml,用乙醇胺调节pH值至2.3,加水至1000ml)-乙腈(74∶26,或适宜比例)为流动相;流速为1.0ml/min;柱温40℃;检测波长为214nm。取系统适用性试验用溶液(取人胰岛素对照品,用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含1mg的溶液,室温放置至少24小时)20μl,注入液相色谱仪,人胰岛素峰和A21脱氨人胰岛素峰(与人胰岛素峰的相对保留时间约为1.3)的分离度不小于1.8、拖尾因子不大于1.8。

  测定法  取本品适量,精密称定,用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释至每1ml中约含0.35mg(约10单位)的溶液(临用新配)。精密量取20μl注入液相色谱仪,记录色谱图;另取人胰岛素对照品适量,同法测定。按外标法以人胰岛素峰与A21脱氨人胰岛素峰面积之和计算,即得。

  4  保存、运输及有效期

  避光,密闭,在-15℃及以下保存和运输。自生产之日起,按批准的有效期执行。


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